1研究内容：运用流式细胞术研究厚壳贻贝暴露于海水酸化和不同温度下的血淋巴细胞免疫功能的变化，包括：总细胞浓度，细胞凋亡率，细胞吞噬活性，非特异性酯酶，活性氧分子产量，溶酶体含量及线粒体电位；

2材料采集：贻贝隶属软体动物门（Mollusca）双壳纲（Bivalvia），是分布于世界各地的一种水产品。我国贻贝资源丰富，贻贝是我国传统的养殖贝类，贻贝生长速度快、繁殖能力强、抗病能力强、也有极强的适应环境的能力，易于人工养殖，品种包括了厚壳贻贝、紫贻贝、翡翠贻贝等。紫贻贝与翡翠贻贝的被水解提取物具有抗肿瘤、抗氧化、抗凝等作用。

我们的紫贻贝从浙江沿海岸渔民采集，采集后尽量快的带回实验室洗，去除贝壳表面的吸附物还有各种污染物，防止养殖的时候发病。然后在实验室的循环水系统中，每个缸都养殖差不多30个左右，然后每天去养藻的实验室去取一桶硅藻的藻液平均喂到每一个缸，期间关闭循环水系统，这样藻类不会大部分都过滤掉，又浪费藻液，也会增加清洗过滤棉的次数。因为每天都会有很多水分的蒸发，所以必须每天观察水位，如果水位过于偏下，则要补水。保证盐度的合适。

暂养一段时间后。每次取4只贻贝的血淋巴液混合然后进行分析，用1ml枪头插入紫贻贝的闭壳肌中抽取血淋巴细胞，每个贝大约抽取1ml ，然后放入对应条件的管子中，放在冰上面以最大限度地减少细胞的自然凝集，抽出的血液理论上应该清澈，但是因为抽血中会插入贝壳的肉，可能会带有一些异物。

带回实验室用普通离心机或者低温离心机大约3000 r/min ，离心10到15分钟。将离心好的匀浆留上清液然后弃下面沉淀杂质。

3实验结果

3.1细胞死亡率

图1表示相同温度（30度）下红色的线代表PH7.3，而淡蓝色色的线条代表PH7.7，绿色线条表示PH8.1条件下PI染色下血细胞的相对荧光强度。Count代表数量，FL1-H代表荧光强度。M3区间的表示活体细胞的范围。而M4则表示细胞死亡，然后被PI染色后表现出很强的荧光区域。不同PH对贝类血淋巴细胞的死亡率比较，在30度条件下 （死亡率PH7.3>PH7.7>PH8.1）。

图1

图2

图2是在养殖周期第1天、第3天、第7天、第14天血淋巴细胞经过PI染色处理后流式细胞仪跑出来的图像，也就是把贝类从原来8.1的PH环境放到了PH7.7的水域25度环境条件下2周的数据变化。红色代表第14天血淋巴细胞经过PI染色处理后流式细胞仪跑出来的图像，蓝色代表第7天的血淋巴细胞经过PI染色处理后流式细胞仪跑出来的图像。黄色代表第3天血淋巴细胞经过PI染色处理后流式细胞仪跑出来的图像，绿色代表第1天的血淋巴细胞经过PI染色处理后流式细胞仪跑出来的图像。总结出25度温度下，PH从8.1变到7.7会使血淋巴细胞的死亡率变高。

图3图4图5

图3、图4、图5分别表示PH都是7.7，红色线表示温度是25度，而蓝色线表示温度是30度。图3是第3天取样的血淋巴，图4是第7天取样血淋巴，图5是第14天取样血淋巴。根据M9、M10、M11三快区域的对比可以得出，25度的温度血淋巴细胞的死亡率要比30度的死亡率低。

3.2吞噬作用

图6表示血淋巴细胞吞噬过微球后荧光出来的图线，黄色代表30度条件下PH为7.3的曲线，而蓝色代表30度条件下PH为7.7的曲线,红色代表30度条件下PH为8.1的曲线。从中可以得出，30度时吞噬效果是PH7.3>PH7.7>PH8.1。

图6

图7

图7表示血淋巴细胞吞噬过微球后荧光出来的图线，黄色代表25度条件下PH为7.3的曲线，红色代表25度条件下PH为7.7的曲线, 蓝色代表30度条件下PH为8.1的曲线。从中可以得出，25度时吞噬效果是PH7.3>PH7.7>PH8.1。

由此可见，PH的降低会导致吞噬细胞的个体数量和活性的增强，这可能跟PH下降，机体免疫下降而引起吞噬细胞要吞噬许多外来和内在的细菌、杂物。这种吞噬性的增强并不能说明机体免疫力的提高，反而增加了机体的负担，不利于贝类的生长。

图8

图8表示吞噬细胞吞噬的能力，在PH为8.1的条件下蓝色表示25度时血淋巴细胞吞噬微球的细胞在流式细胞仪上的荧光强度，红色表示30度时血淋巴细胞吞噬微球的细胞在流式细胞仪上的荧光强度。可见25度时的血淋巴细胞的吞噬活性还有数量都比30度时的贝类的血淋巴细胞的吞噬活性还有数量都大。温度主要会去影响贝类的血细胞总的数量和吞噬作用，因为血细胞会直接影响贝类的免疫防御系统，所以血细胞的数量的变化是评估贝类免疫的水平的重要数据，但是异物的刺激，吞噬作用和胞饮作用会变强，贝类对环境及疾病等胁迫的生理反应，部分是通过血淋巴细胞进行调节^[6]，血淋巴细胞吞噬作用是厚壳贝类内部的防御的主要免疫^[7]。

3.3非特异性酯酶

图9图10

图9、图10非特异性酯酶的检测，M1和M2区表示被染色的区域，这个区域线高度越高说明非特异性酯酶越多，图9表式30度第14天血淋巴细胞经过FDA染色处理后流式细胞仪跑出来的图像。黄色表示PH7.3血淋巴细胞经过FDA染色处理后流式细胞仪跑出来的图像，红色表示PH7.7血淋巴细胞经过FDA染色处理后流式细胞仪跑出来的图像，蓝色表示PH8.1血淋巴细胞经过FDA染色处理后流式细胞仪跑出来的图像，图10表式30度第7天血淋巴细胞经过FDA染色处理后流式细胞仪跑出来的图像。黄色表示PH7.3血淋巴细胞经过FDA染色处理后流式细胞仪跑出来的图像，红色表示PH7.7血淋巴细胞经过FDA染色处理后流式细胞仪跑出来的图像，蓝色表示PH8.1血淋巴细胞经过FDA染色处理后流式细胞仪跑出来的图像。

可以发现，PH7.7时血淋巴细胞经过FDA染色处理后流式细胞仪跑出来的图像荧光最为强烈，可以说明非特异性酯酶在PH为7.7的时候比PH7.3和PH8.1的时候多。

图11

图11非特异性酯酶的检测，M1区表示被染色的区域，这个区域线高度越高说明非特异性酯酶越多，在25度血淋巴细胞经过FDA染色处理后流式细胞仪跑出来的图像。红色表示PH7.3血淋巴细胞经过FDA染色处理后流式细胞仪跑出来的图像，蓝色表示PH7.7血淋巴细胞经过FDA染色处理后流式细胞仪跑出来的图像，黄色表示PH8.1血淋巴细胞经过FDA染色处理后流式细胞仪跑出来的图像，根据这个对比，很明显的25度时候酯酶活性PH7.3>PH7.7>PH8.1,而30度的时候则PH7.7>PH8.1>PH7.3。

图12图13图14

图12、图13、图14分别是PH7.3、PH7.7、PH8.1的PH值，而红色表示30度温度，蓝色表示25度的温度。非特异性酯酶的检测，M区表示被染色的区域，这个区域线高度越高说明非特异性酯酶越多，PH7.3时候由图12看出25度非特异性酯酶活性大于30度，PH7.7时候由图13看出25度非特异性酯酶活性小于30度，PH8.1时候由图14看出25度非特异性酯酶活性和30度时差不多都很弱。

温度对贝类血淋巴细胞免疫的影响，很多的是影响厚壳贝类的一系列非特异免疫相关的一些酶的表达还有活性，即温度会影响各种酶的一些活性，和它在不同温度下的很多生理机能有密切关系。

3.4活性氧分子

图15图16

图15、图16分别是25度温度下和30度温度下活性样分子含量的测定。在M1和M2区域，曲线越高，FL1-H的值越大，表明活性氧分子含量越高。红色曲线表示PH7.3条件下的样品，黄色曲线表示PH7.7条件下的样品，蓝色曲线表示PH8.1条件下的样品。当温度是25度的时候，活性氧分子PH7.7>PH7.3>PH8.1,而当温度是30度的时候，活性氧分子PH8.1>PH7.7>PH7.3。

图17图18图19

图17、图18、图19分别表示PH是7.3、PH7.7、PH8.1的时候，红色曲线表示温度是25度，而蓝色曲线表示温度是30度，当PH是7.3的时候30度温度下的取样样品的活性氧分子比温度是25度的活性氧分子大。当PH是7.7的时候25度温度下的取样样品的活性氧分子比温度是30度的活性氧分子大。当PH是8.1的时候30度温度下的取样样品的活性氧分子比温度是25度的活性氧分子大。

3.5溶酶体含量

图20 图21

图20、图21分别是25度温度下和30度温度下溶酶体含量的测定。在M1和M2区域，曲线越高，FL1-H的值越大，表明溶酶体含量越高。红色曲线表示PH7.3条件下的样品，黄色曲线表示PH7.7条件下的样品，蓝色曲线表示PH8.1条件下的样品。当温度是25度的时候，活性氧分子PH8.1>PH7.7>PH7.3,而当温度是30度的时候，活性氧分子PH7.7>PH8.1>PH7.3。

图22图23图24

图22、图23、图24分别表示PH是7.3、PH7.7、PH8.1的时候，红色曲线表示温度是25度，而蓝色曲线表示温度是30度，当PH是7.3的时候25度温度下的取样样品的溶酶体含量比温度是30度的溶酶体含量大。当PH是7.7的时候30度温度下的取样样品的溶酶体含量比温度是25度的溶酶体含量大。当PH是8.1的时候25度温度下的取样样品的溶酶体含量比温度是30度的溶酶体含量大。