一、研究背景:

细菌、古菌、真菌、微藻以及一些小型或者微型的后生无脊椎动物等，在自然界中的分布非常广泛，是水域生态系统的重要组成部分，其群落结构和群落演变能够反映水体环境对其的影响，同时也对水生态系统的功能产生重要影响。对于水体、底泥、附着基或者大型水生生物肠道内含物等样品中的微小水生生物组成结构的分析，传统的研究方法主要有培养法(细菌、古菌和真菌)和显微镜镜检计数法（藻类和微小后生生物），这些方法都有其自身的缺陷，例如：利用培养法对微生物进行群落结构分析时，90%以上的细菌都无法在人工培养的情况下生长起来；而对于藻类和后生动物的显微镜镜检技术，是需要利用人的肉眼去进行计数分析，定种和计数的主观因素是存在的，较大的误差也难以避免，而且由于计数只对上述物种的整体或者某些身体结构进行统计，对于残缺的生物组织难以定量。因此，为了解决上述问题，加之现代分子生物学技术的发展，利用分子生物学分析环境样品中的生物群落的研究方法便应运而生了。利用DNA分析技术，提取环境样品的总DNA（样品中所有生物的基因组DNA的集合），并通过PCR扩增和凝胶电泳以及测序等技术，实现对样品中物种组成的分析（即群落结构的分析）。分子生物学方法不需要经过长时间的培养，直接从环境微生物中提取DNA进行研究，具有灵敏度高、特异性强等优点，而且能及时地反映微生物的种群动态变化，是研究微生物多样性和动态性的有效方法。

由于大多数分子生物学方法都是以提取研究对象的基因组DNA为前提，因此建立一种高效的环境样品DNA的提取方法具有重要意义，是保障群落结构的分子生物学分析的精确性的关键环节。目前，已报道的从环境样品中提取DNA的方法有很多，主要是从水样、土壤、活性污泥和沉积物等环境样品中提取微生物的DNA。但是在水体或者大型水生生物的肠道内含物的微小生物群落结构的研究当中，样品中的组分是多样的，包括了植物、动物以及菌类的细胞，由于细胞结构的不同（例如细菌和植物有细胞壁，动物只有细胞膜），不同样品的组分也不同，各组分DNA被提取出来的得率也有很大的差异，为了更够准确的确定各物种所占的比例，必须要求我们在DNA提取时能够将环境样品中各种组分的DNA均一等效的抽提出来，关于这方面的研究目前未见。以往的关于DNA提取技术的研究，往往是针对单一类群生物的提取方案研究，或者是对于环境样品的定性研究。研究者往往只考虑到其使用的方法是否能够得到其所需要的生物物种的DNA，未考虑到在精确的群落结构研究中需要提供一个能够均一等效地提取各种生物类群DNA的技术方案，更没有在这一问题上加以深入探讨。虽然目前针对不同的样品类型，有很多不同类型的DNA提取技术，如CTAB法，SDS法，酚氯仿法，高盐法以及层析柱法等诸多提取技术，且市面上有很多类型的试剂盒可供我们选择，但是并没有一个研究来探讨这些方法和试剂盒产品对于不同生物类群DNA的提取效率，我们基于上述背景，拟开展对于环境样品DNA提取方案的开发，通过对现有DNA提取技术的再开发，实现环境样品中各组分DNA的等效提取，以期为分子生物学技术进行水生生态系统环境样品的分析研究的开展提供更好地技术保证。

二、实施方法：

1、研究内容:

通过对培养的细菌、真菌、藻类以及浮游动物的DNA采用不同方法进行提取，利用分光光度法测定样品浓度，以及进行定量PCR实验，比较各种样品的DNA提取效率和效果，找到3-4种最合适的DNA提取方案。利用上述方案对已知比例的混合组分的样品进行DNA提取，通过定量PCR验证各组分所占的比例是否与混合比例一致，从而选择2种以上可行方案。由于环境样品（尤其是底泥和肠道内含物）中大量抑制剂的存在影响DNA的提取效果，再通过对野外采集来的肠道和底泥样品进行DNA提取并对提取的DNA质量进行比较验证，从而确定一套最优的用于群落结构分析的环境样品DNA提取方案。由于DNA提取一般分为样品的预处理、细胞裂解、DNA的提取、DNA的纯化四个环节，每个环节的方案也都有多种方法可以选择，因此我们在探讨DNA提取方法的时候，会根据我们的样品情况，对各环节的不同处理方法进行合理的组合，并结合市售的试剂盒对原有DNA提取方法进行改良，以满足我们的实验要求和研究目的。

2、研究方法

本研究分为三个阶段：

（1）对于不同类群的纯种样品的DNA提取和效果评价：拟确定8-12中DNA提取的方案，对这些方案对于不同类群DNA提取的效果进行评估，评估主要分为DNA质检（包括电泳和分光光度法）和常规的PCR检测。

（2）对于不同类群的混合样品的DNA提取和效果评价：在上述DNA提取方案中选择选择3-4种较理想方案，对这些方案在混合样品中的提取效果进行评估，评估方法主要采用DNA质检（包括电泳和分光光度法））和定量PCR技术以及克隆测序。

（3）对于含有抑制剂的环境样品的DNA提取效果的评价：采集若干池塘底泥及鱼类肠道内含物样品，选取2种以上较优方案对于这些样品进行DNA提取，对这些方案的提取效果进行评估，评估方法主要采用评估方法主要采用DNA质检（包括电泳和分光光度法））和常规PCR技术，定量PCR技术以及二代测序技术。

最后，对上述三部分实验结果进行总结，形成一套用于群落结构分析的DNA提取的技术方案，并对研究过程中的结果进行分析讨论。

3、可行性分析

我们团队的四名同学都有着水产养殖和水域生态学及其分子生物学的良好的知识背景，对于这一研究领域兴趣浓厚。指导老师刘其根老师实验室具有良好的环境生态学和分子生物学实验平台，如培养纯种生物的培养箱、超净台、分子生物学所需要的PCR仪、离心机等都一应俱全。刘老师及其团队的老师和研究生的水域生态和分子生物学专业背景也为我们的研究起到了良好的辅助作用。实验设计合理，实验进展安排得当，实验目的是可以通过我们的工作所达到的。因此，本项目具有良好的可操作性。

（三）、预期效果

形成一套用于群落结构分析的DNA提取的技术方案，并将我们的技术方案用于刘其根老师的实验室研究当中，并通过专利申请和文章发表的形式，积极推广到其他开展相关研究的实验室。

水域生态学的研究当中，环境生物的群落结构研究是经常被关注的领域，传统的研究方法如培养法(细菌、古菌和真菌)和显微镜镜检计数法（藻类和微小后生生物），这些方法都有其自身的缺陷。如何能够准确和高效的对微小生物群落进行群落结构分析，分子生物学方法无疑是一个有效的途径，但是，分子生物学研究方法自身也存在一些需要解决的问题。其中，DNA提取就是最为关键的一个环节。为了实现微小生物群落的精确分析，必须获得一种可靠的能够等效的提取环境样品中各生物组分DNA的提取方案。为了解决这一问题，我们四人研究团队拟在刘其根老师的指导和带领下，申请并开展本项目。

自开展了此项目以来，每位小组组员都能用心的研究项目内容，按照项目计划书来开展，认真完成项目部署。而且上了大二以来，我们了解了很多相关的专业知识，在进行实验的过程中我们也得心应手了很多。我们敢于吃苦、脚踏实地、善于创新，我们小组成员均拿到人民奖学金。我们经常与导师联系，对实验室的基本操作有了一定的掌握，并且积累了宝贵的经验，这必然对我们目前的实验有着不小的帮助。 虽然都是第一次参加大学生创新活动，但是我们之前都有相关方面的积累经验，又有研究生师兄的帮助，所以在此项目实施过程中我们面临的困难相对较少。实验进程在预期的阶段内，希望可以在最后的规定时间内我们完成此项目。