本实验具体计划如下：

（1）在上海海洋大学循环水养殖系统中收集养殖固体废弃物

（2）利用生物絮凝技术，在设施渔业实验室内，通过控制水体中的C/N，在适度的搅拌强度条件下，培养以及强化培养生物絮凝体。并且后期测定絮体的营养成分。

（3）将不同强化手段培养的生物絮凝体分别用于卤虫的营养强化。

（4）将强化后的卤虫收集存样，用于测定初蛋白、氨基酸、总脂及脂肪酸等营养成分。

（5）处理数据，分析各组的营养强化效果

本小组成员在老师指导下，以进行了第一阶段的循环水养殖系统中收集养殖固体废弃物与第二阶段的利用生物絮凝技术，在设施渔业实验室内，通过控制水体中的C/N，在适度的搅拌强度条件下，培养以及强化培养生物絮凝体。在第三个阶段中进行了两次实验。采用不同浓度的生物絮凝体分别用于卤虫的营养强化。前两次实验均失败，但我们从失败中总结出许多不足之处。以下是我们经过失败后优化的具体实验方案：

实验题目：在生物絮凝体可作为卤虫的饵料的前提下，研究絮体在饲养卤虫的最适的投喂浓度。

实验设计思想：利用絮体投入水体后水体的透明度来表示投喂浓度，通过设置一定梯度饲养水体透明度来研究絮体在饲养卤虫时的最适投喂浓度。实验过程中对卤虫的体长、体重和存活率进行记录。最后测定卤虫各项指标（体长、体重、存活率、脂肪酸（EPA,DHA）含量、初蛋白含量、必需氨基酸总量等），并用小球藻作对照组进行实验。探讨生物絮凝体饲养卤虫的最适浓度。

实验目的：1.学会培养和扩培小球藻

2.学会孵化和养殖卤虫

3.学会测定卤虫的各项指标

4.探讨生物絮凝体在饲养卤虫中的最适浓度

实验方法：1.小球藻的培养方法：培养液：BG11配方配置；培养条件：每天光照12小时，26℃环境中培养，每天摇藻两次，每周扩培一次。

2.卤虫孵化方法：卤虫卵在自来水中浸泡1小时，滤出，移入盐度为20的海水中，充气，连续光照40μmol/ m2s、恒温28℃，PH值为8-9，孵化。24小时后可孵化出卤虫无节幼体。分离无节幼体进行养殖。

实验材料：

小球藻藻种（来源：）锥形瓶若干，BG11培养液若干，滤纸若干，细绳若干，针管若干。

卤虫卵（来源：）增氧机、气石25个，光管若干，一升容量的烧杯50个，150目的筛绢袋若干，120目的筛绢网袋若干。

生物絮凝体（来源：）细胞粉碎机。

实验步骤：1.安装孵化容器（气石）消毒，准备孵化用水（盐度为20，PH值为8-9），配置0.2%的甲醛溶液（或300mg/L的高锰酸钾溶液）。

2.将卤虫卵装入150目的筛绢袋中，在自来水中充分搓洗，直至搓洗后的水较为澄清。将卵放在洁净的淡水中浸泡1小时。放入0.2%的甲醛溶液浸泡30min，用海水冲洗至无味（或用300mg/L的高锰酸钾溶液浸泡5min，用海水冲洗至流出的海水无色）。

3.把消毒好的卤虫放入孵化器中，控制各孵化参数（不断充气（气石），连续光照40μmol/ m2s、恒温28℃，海水盐度为20，PH值为8-9）。

4.准备好小球藻组和生物絮凝体组的养殖塑料桶并配置好。（小球藻3个塑料桶（5升的），一个一组，3组平行组，生物絮凝体15个塑料桶，5个一组，3组平行组），4升的水体（不断充气（气石），连续光照40μmol/ m2s、恒温28℃，海水盐度为40，PH值为8-9），加小球藻透明度为375px，加絮体透明度依次为275px，325px，375px，425px，475px。

5.24小时后，停止充气，在孵化器顶端蒙上黑布，在黑暗环境中静置10min。缓慢打开孵化器底端的出水阀门，将最先流出的未孵化卵排掉，在出水口套上120目的筛绢网袋，收集无节幼体。

6.将无节幼体移到装有干净海水的塑料桶中，（利用光诱再次分离，得到较纯的卤虫无节幼体）得出M1高密度液体。计数密度，计算每升水体所需的高密度液体（1000只每升），按计算所得加入烧杯组中。

7.在此环境中培养：不断充气（气石），连续光照40μmol/ m2s、恒温28℃，海水盐度为40，PH值为8-9。每天投饵四次(早上8点，中午13点，下午17点，晚上21点)，投饵量以透明度为标准。

8.对卤虫进行连续20天的培育，每天记录卤虫各项指标（体长、体重、存活率）。最后对卤虫进行营养检测(脂肪酸（EPA,DHA）含量、初蛋白含量、必需氨基酸总量等）

根据以上的将进行的实验方案，并且我们总结了前两次实验失败的原因得到了一些经验：

第一次孵化失败：直接用休眠的卤虫卵进行孵化没有进行24小时的淡水浸泡，导致孵化失败。

第二次实验我们利用絮体投入水中后水体的透明度作指示对卤虫进行絮体（湿）投喂浓度的测试，以小球藻做对照。絮体组卤虫3-10逐渐死亡到第11天基本无活体；小球藻组在第12天大规模死亡。到第13天停止实验。分析：絮体组我们一天投喂两次早上与下午，前期早上投喂后到下午水体透明度变化不大，后期实验水体变化明显。往后实验可能以小量多次，前期少后期多的投喂方式。絮体组死亡原因絮体投喂过多水体氨氮过高导致水质变差。小球藻组未知）

以下是之后实验所用的检测方法总结：

脂肪酸测试方法和具体步骤

仪器：美国安捷伦公司7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）；色谱柱：DB-5ms（30m×0.25mm×0.25µm）；进样量：1μL；进样温度：270°C；分流比：无分流；载气：氦气（99.999%）；流量：1mL/min；柱温：70°C保持5min，以25°C /min升至200°C，以2°C /min升至280°C；接口温度：280°C；离子源温度：230°C；四级杆温度：150°C；电离方式：EI+，70ev；检测器电压：1765V；扫描方式：全扫描；溶剂延迟3.5min；质量范围：33~500；NIST 2011谱库。

试剂： 19:0甲酯、H2SO4 、0.9%氯化钠、己烷和氮气

样品前处理方法步骤：脂肪酸的甲基化

1. 适量样品（50mg左右）+ 1.0ml（1NH2SO4）+ 100ug内部标准（ 19:0甲酯，10ul从10mg/ml）在螺旋盖的管。

1NH2SO4配制：

硫酸浓度为0.5mol/L，近似5%。用1000ml容量瓶制取，需要49g硫酸在烧杯溶解冷却后，用玻璃棒转移到容量瓶中，并且用蒸馏水洗涤烧杯，洗涤液也转移到容量瓶，然后往容量瓶中加入蒸馏水，当液面离刻度线2~3厘米时，改用胶头滴管至凹液面与刻度线持平

2. 用组织研磨机60hz处理样品30min。

3. 鼓入N2排出空气（10秒），样品密封管与帽立即置于80℃恒温加热90分钟。

4. 取出样品密封管置于冰箱冷鲜10分钟

5. 加1.5毫升0.9%氯化钠和300ul正己烷和旋涡20秒，然后在4000转5分钟

6. 带上相（正己烷相）的气相色谱分析

氨基酸测试方法

前处理主要是游离氨基酸提取和除蛋白，如下：

1、称取适量样品，按大约100mg：3ml的比例（视需要调整）加入一定量的0.1mol/L盐酸（优级纯），盖紧管盖，并用封口膜密封。

2、vortex充分溶解摇匀，浸泡，超声波40℃提取0.5-1小时。（期间需注意观察，样品需充分提取，不可结块或粘壁）

3、提取结束后，摇匀，静置、过滤或离心取上清（视需要，4℃ 6000rpm离心5-10min）。

4、离心结束后，取上清水层，加入等体积10%的三氯乙酸或磺基水杨酸（W/V），vortex混匀，-20℃静置20min，4℃静置1h，再4℃12000rpm以上离心30min。（若上清浑浊，提高离心转速或过滤。）

5、离心结束后，取上清水层，加入氢氧化钠溶液调pH值1.7-2.2之间（多用8mol/L NaOH调pH，通常每800ul上清加入约23ul 8mol/L的NaOH）。

6、4℃转速12000rpm以上离心15min。（这一步是为了将蛋白质沉淀完全，由于pH改变，有些样品会浑浊）

7、用0.22µm滤膜过滤样品溶液，过滤注意弃去前几滴。

说明：

1、调整样品浓度，对样品进行浓缩或稀释，使最终样品中每种目标氨基酸浓度约100nmol/mL（即十几mg/L）。样品如需稀释，用0.02mol/L的盐酸（优级纯）作为稀释液。

2、调整样品pH，使最终样品pH约2.0（精密pH试纸参照0.02mol/L盐酸）。氨基酸分析仪通过离子交换分离，保留时间显著受pH影响，这一步绝不可少。

具体步骤：

样品前处理时间：2014.09.27

1.称取0.05克左右样品（卤虫干样）置于1.5毫升离心管内，加钢珠。

2.往每个离心管内加入1mL 1mol/L HCl，研磨。

3.置于超声波清洗仪内震荡充分溶解。静置分层。

4.取上清液0.5ml置于新的1.5毫升离心管中，加入0.5ml磺基水杨酸，震荡混合。

5.将离心管置于-20℃环境中15min，然后冷冻离心30min。

6.取上清液0.5ml，置于新的离心管内，加入24µL 8mol/L氢氧化钠（将PH调至2.0左右，用试纸比色）

7.取上清液0.5ml，置于新的1.5毫升离心管内，过滤。

8.取160µL过滤液装瓶。置于4℃环境，等待上机检测。