项目背景

虾蟹类是甲壳动物亚门中最大的一目，共约9000多种。其中主要是虾和蟹。它们的特征是保持虾形或变为蟹形。体分头胸部和腹部。头胸部具发达的头胸甲，腹部发达（虾类）或退化而折于头胸甲下(蟹类)。第2小颚外肢发达，形成颚舟叶。胸肢前3对特化为颚足，后5对为步足。鳃数列，着生在胸肢基部﹑胸部侧壁或其间的关节膜上。大多数种类发育过程中有明显变态，刚孵化的幼体是无节幼体或原溞状幼体。

蟹类年龄确定

1、蟹属于节肢动物，靠退壳生长，退壳后不留痕迹所以不能像鱼类那样依据鳞片的一年为一周期的年轮判断也不能像哺乳动物或爬行动物那样依据骨骼的疏密程度判断。

2、蟹的生长速度主要依靠食物、气候和品种，同种同龄螃蟹大小可以有悬殊差距，所以也不能看大小但可以依靠高科技手段，根据目前甲壳情况推断出螃蟹的大约年龄为3~5周岁。

3、通过观察螃蟹的切齿磨损程度也可以判断但是结果会不太准确，并且还要考虑到品种，如在正常的食物供应下，白斑平滑梭子蟹的切牙磨损85%，此时壳展大约为25厘米（XX，）。

中华绒鳌蟹

中华绒鳌蟹俗称河蟹，雌性幼蟹腹甲边缘长满刚毛为二秋龄,无刚毛为一秋龄；雄性幼蟹第七腹甲无突起为一秋龄,有突起为二秋龄。

虾类年龄确定

1. 体长频度法 2.年龄色素 3.多变量形态分析 4.复眼

体长频度法

体长频度法为估算南极磷虾年龄的传统方法,尽管体长频度法存在诸多不确定性,但该法在磷虾年龄确定方面仍有较为广泛的应用。

年龄色素

年龄色素是动物氧化代谢所产生的废物,储藏于身体的细胞中,并且其含量随着时间的推移(氧代谢)而增加。年龄色素可用于种群分析,特别是对于个体太小不可能进行年龄组划分的种类, 但也存在着诸多的问题尚需解决。针对其他生物的可溶年龄色素荧光检测方面的研究仍存在较多的不确定性。目前,该技术分析南极磷虾的年龄已经得到一些有用的信息, 实验室研究结果表明,在被捕后一年内,一些可溶性的荧光年龄色素随着年龄的增加不断积累,而其体长则显著缩小。

多变量形态分析

一些学者尝试利用多变量形态分析获得南极磷虾年龄结构方面的信息。尽管该方法在分离雌雄成体年龄组方面取得了一些初步的有前景的结论,但其他的研究仍未采纳该技术开展进一步的探索。

复眼

近年来, 一些学者通过眼球大小与体长之间的关系分析南极磷虾的年龄。体长与眼径之间的比率也可以作为磷虾种群是否存在负生长的监测指标。尽管该方法并没有在其他海区的野外样本中得到验证, 但其也不失为一种重要的可操作性的年龄鉴定方法: 利用晶锥数目或复眼直径从新补充体中区别高龄组虾体。该方法也为估算南极磷虾补充和死亡等重要参数提供了足够的信息。南极磷虾在其一生中不断地进行蜕皮, 因此在外部形态上没有留下记录其生长的特征(例如鱼类的耳石和鳞片上的生长轮)。在甲壳动物的研究中, 年龄鉴定的传统方法是依靠测量其体长、进行体长频数分布分析来完成的。

而以上这些年龄测定方法是不完善和不精确的。近日，有学者发表了有关于测定龙虾年龄的相关论文。通过龙虾的眼柄和胃磨切片观察到直接与年龄相对应的生理结构。这对找到对中华绒螯蟹年龄的直接测定的方法，以及对我们以后养殖重量比一般大的中华绒螯蟹有着重要的意义。

项目方案

我们平常养殖出售的是二秋龄的中华绒螯蟹。一般一只的重量不超过半斤，而有些个别极大。这些巨大的螃蟹会引起人们的关注，甚至卖出天价，对养殖户有着极大的效益。因此，我们对这些巨大的螃蟹成长过程有着一些猜测。猜测是否因为生长的年龄更长而导致重量突出，这是我们集中的猜测之一。因此，找到对中华绒螯蟹年龄测定的方法，对我们以后养殖重量比一般大的中华绒螯蟹有着重要的铺垫意义。

项目研究的内容：测定中华绒螯蟹的年龄。

项目研究的方法：参考测定龙虾年龄的实验结果，自主设计可行的实验步骤，对中华绒螯蟹进行对比观察研究。

1. 制作样本

   先麻醉样品蟹，移除其眼柄和胃磨。清洗后植入冷硫化的环氧树脂中，再进行横切或纵切。用环氧树脂封装在载玻片上，并用粗砂抛光薄膜将之磨光。用于90%的乙醇溶液下的透射光，在10*-40*放大率的显微镜下观察。

2. 未知对照组

   在未知动物的实际年龄或者未以蟹壳形状为基础的估计年龄的情况下，观察计算从基底（相邻的膜质层和皮下组织）到远端区域的内表层。用“image J”软件去测量每一个生长物带状物的宽度。成对记录左和右的眼柄的两个独立的相同结构的带状物数据的精度（重现性）和变量。

   3）对16—63mm连续的不成熟的蟹进行试验

   它们被允许去脱一次皮去决定是否生长和形成与时间有密切关系。在单个的眼柄切除之后（在麻醉的情况下），每天监测样品蟹，然后他们会在六个月脱壳后再次麻醉移除另一眼柄。蟹蜕皮前期和后期的眼柄部分需要准备、检查和注射。

   4）确定通过蜕皮被保护的角质层是否有任何的矿化特征

   观察标本中含荧光标记钙黄绿素，在脱皮之前或脱皮过程中，是否返回到了有规律的保存条件。

   5）数据收集及处理

   截面的眼柄和胃磨如上准备好制成标本，之后借助于共焦激光扫描显微镜在放大10倍到40倍的透射光下观察，发现了钙黄绿素。我们使用了可以用两个不同的激发波长去区别钙黄绿素标记（520到530nm，绿色）和自然自发荧光（600到790nm,红色），记录下了数据影像。被修正的背景形象突出钙黄绿素标记用Adobe Photoshop12 通过减去绿色图像通道中的红色图像通道，然后转变成灰度级。

   项目研究的可行性分析：

   1）在虾蟹类年龄测定的研究方面，已经有许多学者的投入和部分发现，有许多相关的文献资料，这对于我们的项目有巨大的辅助作用。

   2）同时我们有足够的实验室资源和专业的导师来进行和指导我们的项目。

   3）上海市每年都会有河蟹比赛，河蟹文化节，十分方便我们采集样本。

   
   

   
   

   项目进展汇报

   1）确定项目明细计划分步，分为三步。第一步，找到胃磨组织，学习切片技术，用成熟的中华绒螯蟹做实验切片进行观察。第二步，定期到养殖场中采集不同褪壳次数的中华绒螯蟹，进行切片制作观察。第三步，探究其他种类的螃蟹年龄的直接鉴定，探究中华绒螯蟹年龄与部分生理功能的关系。

   2）第一步基本完成，通过对中华绒螯蟹的解剖和在文献库中的搜索，找到了胃磨组织。通过和组织胚胎学老师的沟通，学习了制作切片的技术。由于制作的前期没有进行组织固定，做出的切片效果不好，我们不能很好观察到组织的结构。所以制作蜡块和切片技术，我们需要多加练习。

   2015年3月10日：小组成员和导师进行项目计划的分析讨论，提出可能的问题。

   2015年3月17日：阐述小组成员对上次讨论中的问题的解决办法，和导师进行交流。购买实验用品。

   2015年3月27日：购买中华绒螯蟹。配置实验试剂，对标本进行切取，进行固定。

   2015年4月9日：将标本脱水，制作蜡块。

   2015年4月16日：将标本脱水，制作蜡块。

   2015年4月17日：制作切片

   2015年4月18日：将切片标本反脱水，观察。