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发布日期:2015-12-24
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社会实践:轮虫代替草履虫成为斑马鱼幼鱼饵料

项目小结:

201310月开展该项目以来,面临了重重困难。最初的研究方向为玻璃彩旗鱼精液的冷冻保存及人工授精,该想法的来源于模式动物斑马鱼由于后期胚胎发育产生的细胞色素阻碍了一些研究的进行,而玻璃彩旗鱼以其独有的优势--发育过程中身体完全透明,可作为更加良好的模式生物,但因为其产卵周期没有斑马鱼这般明确,胚胎发育也不太同步,所以想通过人工受精的方式,获得同步发育的胚胎,以用于研究。

为了能更好的开展此项目,通过导师刘志伟老师的推荐,在14年暑假期间到北京大学斑马鱼研究组张博研究组,学习精液冷冻保存的技术,回校后多次尝试解剖玻璃彩旗鱼精巢提取精液并冷藏保存。同时多次尝试从雌鱼挤卵开展体外授精,但无一次成功得到受精卵,推测可能是玻璃灯鱼挤出的卵质量较差所致。由于每次冷冻精液需要宰杀2-3条雄性亲鱼,而实验室雄鱼数量有限,因此我们计划增加亲鱼养殖数量以便继续开展该项工作。而一代亲鱼培养需时3-4个月,因此考虑更换题目

该题目的来源于实验室在进行的另一项研究,实验室进行用cas9技术诱导产生转基因鱼的实验。

斑马鱼是一种公认的优秀的脊椎模式动物,它具有胚胎透明,生殖周期短,易于培养等优点,因而广泛地用于胚胎发育以及人类疾病的研究模型。作为疾病模型则需要斑马鱼具有够多的突变体,近几年cas9技术的发展,使得在实验室培养条件下能获得较多的突变体模型,但某些突变体由于某些基因的改变使得本身的成活率较低,并且利用传统的草履虫作为幼鱼的开口饵料又大大降低了幼鱼的成活率,所以本实验是尝试用褶皱臂尾轮虫作为幼鱼早期的开口饵料,以获得较高的成活率。玻璃彩旗鱼也作为本实验室的脊椎动物研究模型,由于其幼体体型较小,且对水质变化敏感,所以使用草履虫做为开口饵料极易死亡,所以考虑使用轮虫作为其开口饵料。

轮虫自Migukwari最初作为鳗鲡的开口饵料以来,以具有多年的发展历史。现今轮虫作为优质活饵料的用途越来越广,有关轮虫培养的报道也层出不穷。轮虫是一种小型的滤食性浮游动物,一般体长在100-400um之间,轮虫是以细菌、霉菌、酵母菌、藻类、原生动物及有机颗粒为食的杂食性生物,由于其食性较广,所以培养并不复杂。在轮虫的生产培养中常用的饵料是藻类和酵母,使用酵母作为轮虫饵料可使得轮虫具有高的密度,但由于食用酵母的轮虫体内并不富集DHAEPA,并且酵母喂养残饵过多容易使水质恶化等原因,所以难以达到更好的效果。所以我们尝试用轮虫代替草履虫做为开口饵料。

实验以小球藻作为轮虫的饵料,藻类的养殖以半连续的形式培养,在自然光条件下进行培养。藻类培养用水使用普通自来水,经121℃,,131kpa,进行20min的灭菌处理,即可由于小球藻的扩增。因为普通自来水中含有其他的杂藻和微生物,可能会影响小球藻的生长,所以要进行高温高压灭菌处理,并要冷却后才能进行使用。值得注意的是藻种的扩增必须要在早上进行,因为新扩增的藻种要先进行光合作用的光反应阶段,所以要接受长时间的光照。中午由于温度过高,也不利于藻类的扩增。

同时此实验的藻类是在自然条件下培养的,冬夏温度及光照条件不一致,所以培养出的藻类的质量及浓度不一致,所以实验正尝试在可控的条件下稳定的培养小球藻。藻类培养的营养盐,根据F2营养盐配方配制。

藻类养殖过程中要进行藻类生长曲线的绘制,生长曲线的绘制方法由陈桃英老师指导,由于对此不擅长,所以重复了多次,才获得了现在的结果。在实验中生长曲线的绘制我采用了分光光度法进行测量,首先要选择一瓶浓度最高的藻类将其梯度稀释,并使用计数板计量每个浓度藻类的密度和使用分光光度计测量每个浓度的OD值。绘制出藻类浓度测量的工作曲线。此项工作在整个生长曲线的绘制过程来说,是相当繁重的,特别是对于此一点经验都没有的我,开始是由于计数板的使用方法不正确,加以修正,第二次是由于忘记测量OD值,不得不再次进行计数。从这个实验中我得以反思,科研实验向来是繁琐的,其中一个环节的出错,会导致最终的结果,所以进行科研工作必须要有足够的耐心且细心。

做完藻类的工作曲线接下来是要每天对藻类进行OD值得测定,从新接藻种的第一天开始到明显观察到藻类开始大量死亡(变黄)为止。此项工作并不复杂,但需要坚持每天在同一时间点进行测量,不可漏过一天,这样实验数据便不准确。所以完成此工作也是需要足够的恒心。

藻类培养后便是使用藻类来培养轮虫。轮虫也要绘制出它的生长曲线,要了解出它在第几天时达到最高的浓度,才能确定使用第几天的轮虫进行扩增及其用来作于幼鱼的饵料。轮虫的生长曲线的绘制与藻类的生长曲线的绘制有很大的不同,轮虫的生长曲线的绘制,要在每天进行取样,并用浮游生物计数框,对其进行技术,并计算出其密度。每次计数取1ml的轮虫培养液,数出轮虫的个数,至少要进行3次,保证其误差小于3%,若大于3%便要重新计数,直到有3组数据的误差小于3%为止。这也是一个繁琐的过程,当轮虫密度达到最高的那几天,往往计数的误差很大,所以要反复数上十几次才会有小误差的数据可用。

使用得到的轮虫进行小鱼的喂养。理论上要对小鱼的成活率进行计算,才更有说服力,但由于转基因鱼有限且时间有限,所以此项工作还未完全完成。但实验室中很早之前便使用轮虫作为饵料养殖较不易成活的玻璃彩旗鱼,获得了较好的成活率。

总而言之,此次的创新项目使我收获颇丰,特别感谢我的指导老师,以及在实验中为我提供帮助的老师及同学,此活动开办的十分有意义。