1. 背景

发光细菌的发光现象一直是人们十分关注的问题, 各国科学家对此进行了多方面的调查研究。国内对发光细菌发光的观测研究已有多年历史。在国标《海洋调查规范》中, 早已把”海发光”列为调查内容, 其中”弥漫型”发光便是由发光细菌产生的, 作为常规观测项目之一, 已积累了许多现场观测资料。近年来, 由于实际应用的需要, 对发光细菌的观测研究有所加强, 如现正进行的西北太平洋环境调查研究项目中, 就包含了发光细菌的分布调查。有关发光细菌的研究内容相当广泛, 从近期国内外发表的文献资料看, 主要有发光细菌的发光机理, 发光基因、荧光素酶、发光特性以及某些应用方法等研究。在发光特性研究方面, 以往更多地侧重于细菌发光与其体内物质、结构关系的研究, 即侧重于微生物学和生物化学方面的研究, 而在环境要素和细菌种类、密度等对细菌光谱的影响方面的研究相对较少。在发光细菌的研究中, 发光特性及其应用研究是一项重要内容。利用细菌的发光特性,开展应用研究, 尤其结合光学原理, 制作某些传感器, 用于环境污染监测, 已引起国内外广泛重视。为了研究发光细菌发光特性的应用前景, 首先必须深入了解发光细菌的性质, 积累发光细菌发光特性的基础资料和研究经验。然后, 依据细菌发光的不同特性和应用可能性, 开展相应的应用研究。此类研究不仅可为细菌发光特性的应用提供有效方法, 并将促进生物学、光学、生物化学之间交叉学科综合研究的发展,为从物理学角度研究发光细菌提供依据。为此, 本文拟在简要综述发光细菌的分布特点与发光机理研究基础上, 论述发光特性及其在环境污染物监测、发光细菌分类、水下通讯探测和水色遥感上的应用研究现状, 为进一步开展发光细菌发光特性的应用研究提供借鉴。

1. 发光机理

发光细菌是一类从水中或者从动物体表、消化道和发光器官上以及海底沉积物中可以分离到的, 在适宜条件下能够发射可见光的异养细菌。海洋中的发光细菌, 除了在海水中自由浮游生存的外, 还有寄生于其他海洋生物体的。许多海洋生物的发光与发光细菌有关, 如某些鱼类、软体动物等的发光是由海洋发光细菌寄生、共栖生存所致。海洋发光细菌的种类不是很多, 但其分布却非常广, 从海表层至深海; 从热带海洋至非常寒冷的极地海域都有其踪迹。为了更好地掌握发光细菌的发光特性及应用可能性, 除需要了解发光细菌的分布特点外,也有必要对发光细菌的发光机理作简要介绍。发光机理的研究结果表明, 不同种类的发光细菌其发光机理是基本一致的, 都必须有细菌荧光素酶( LE)、还原性的黄素单核苷酸 ( FMN# H2 )、氧气( O2 )、长链脂肪醛 ( RCHO ) 的参与, 大致历程如下:

FMNH2 + LE y FMNH2 # LE + O2 y LE #

FMNH2 # O2 + RCHO y LE # FMNH2 # O2 #

RCHOy LE# FMN+ H2O + RCOOH+ 光

概括地说, 细菌生物发光反应是由分子氧作用, 胞内荧光酶催化, 将还原态的黄素单核苷酸及长链脂肪醛氧化为黄素单核苷酸 ( FMN ) 及长链脂肪酸, 同时释放出蓝绿光。发光细菌发出的光是连续的, 属“冷光”。这是一种化学发光类型,在化学能转换为辐射能的过程中发光。荧光素酶是菌体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称, 细菌荧光素酶是含 A、B两个多肽亚基的单加氧酶, 只有两个亚基共存时才有活性。从不同海洋发光细菌中提取的细菌荧光素酶其分子量差别较小。由于发光细菌发光细胞内含有荧光素和荧光素酶, 有了氧气, 细胞内的荧光素就受到荧光素酶的催化作用而吸收能量, 变成氧化荧光素并释放光子而发光。不同种类的海洋发光细菌可产生不同的荧光素酶, 发光特性也不同。

海洋发光细菌的发光特性研究, 包括不同菌种所具有的特异光谱特性研究, 发光强度、发光特征参数和发光条件对细菌发光的影响等项研究,以及不同种类的发光组分和酶结构的差异研究。各种生物发光的本质大体一样, 都是由一组化合物，如荧光酶和高能化合物腺苷三磷酸等构成发光光源。它们发出的蓝、青、绿、黄、橙等不同颜色的光, 是因为各自的荧光素、荧光酶在结构上的微小差异引起的。发光细菌的光谱范围约420~ 670 nm, Kmax在 475~ 485 nm左右, 为单一发射峰, Kmax和半峰全宽有种属差异。从发光特征参数发光量子产率来看, 其生物发光反应特点是高光子产生效率: 0. 5 ~ 0. 8。通过发射光的比率可以推出未知成分的浓度, 因此测定化学反应过程中的发射光是非常有用的。反应过程中产生的光与发射光的量子产率是直接相关的, 与相应的发光物质的浓度成比例。因此, 反应过程中的光可以相对反映出目标样品中发光物质的量。有关生物发光共振能量转移是指在一个发光或荧光供体和一个荧光受体如绿色荧光蛋白的突变体GFP)之间会发生能量转移。利用这种方法可以非侵入性地监测特异蛋白质-蛋白质之间的相互作用。

1. 研究方案

（一）、问题的意义和实用前景：

1、发光细菌的应用在我国目前只停留在毒性检测领域，而其在其他领域，如观赏价值等并未有所开发，因此我们团队将着力于发光细菌的培养与应用，如观赏价值的开发。

2、目前，国内有关发光细菌的连续培养技术尚不成熟，在研究发光细菌连续培养技术的同时，可以借此技术延长其发光时长，提高观赏价值。

（二）、研究内容：发光细菌的连续培养。

（三）、研究方法：文献参阅+实验法。

（四）、可行性分析：

1、学校有相应的实验室及相关实验设备；

2、时间比较充裕，有利于全面研究；

3、国内已有发光细菌的冻干粉，价格低廉易于获取；

4、培养所需条件比较少，培养成本低，易于大量培养；

5、连续培养技术在其他细菌培养方面已有应用，可拓展至发光细菌的培养。

（五）、预期效果：发光细菌成功连续培养，能够长时间保持其较高的发光强度。

四、实验过程

（一）实验材料

1、培养基：酵母膏5g、胰蛋白胨5g、甘油3g、混合盐12.5g（MgSO4 2.475g、MgCO3 0.7875g、MgBr2 0.0925g、MgCl2 0.0925g、 CaCO3 0.0275g、KCl 0.22g、NaCl 8.295g*、Mg(HCO3)2 0.505g）

2、仪器试剂

显微镜、血细胞计数板、吸管、量筒、锥形瓶、温度计、无菌操作台、分析天平、分光光度计、青海弧菌Q67冻干粉、复苏液

（二）实验内容

1、探究生长周期

（1）在无菌操作台称量少许青海弧菌Q67冻干粉并记录质量，放入已经过杀菌处理过的烧杯中，加入复苏液复苏，控制温度在20℃左右，记下复苏时间。

（2）将培养液按梯度*加入菌液中，振荡均匀，取样记录各梯度菌液对应的光强值并记下对应梯度下的菌液体积。待光强接近于0时记录此时培养液体积。（菌液稀释浓度—光强关系曲线）

（3）将此时的菌液继续培养，设置三组平行实验，每隔半小时取样记录光强和利用血细胞计数板计算该光强下对应的细菌浓度。（生长周期曲线）

（4）绘制菌液稀释浓度—光强关系曲线和生长周期曲线，生长周期曲线分别以光强和浓度作为纵坐标，时间作为横坐标。

2、探究影响发光效果的最适条件①PH②温度③氧气含量*

该实验所用的菌液浓度为生长周期曲线中对数生长期末段对应的菌液浓度。

①通过调节并记录混合盐中MgSO4和MgCO3的质量来调节pH，在不同pH梯度下培养细菌至死亡期，每隔20分钟取样测定光强。找出最大量和最小量（pH6~9）

②4℃为梯度设置五组实验，在不同温度下培养细菌，每隔20分钟测定光强。（10~30℃之间）

3、第一次实验数据处理

利用表格记录数据，通过绘图找出规律。

（三）实验步骤

（1）LB培养基（2）淡水发光细菌培养基

①按配方称量试剂①按配方称量试剂

②用烧杯配制500ML②用烧杯配制1L

③灭菌20min③静置

④冷却④取上清液灭菌20min

⑤接种培养8H⑤冷却

⑥接种培养8H

单位：ML

（四）实验结果

0：不发光

+：发光弱

++：发光较弱

+++：发光一般

++++：发光较强

五、实验小结

经过初期实验，我们成功利用液体发光细菌培养基扩增培养出了大量青海弧菌，为接下来的实验提供了大量实验用细菌。并且，通过浓度梯度培养，掌握了不同浓度下细菌的一步生长曲线，为后期实验确定了最适的细菌浓度，完成了前期的实验计划。